与其他结构生物学家一样，Eva Nogales赶上了好时机。这位美国加州大学伯克利分校的教员现在可以利用新工具，解决几年前根本无法解答的细胞分子机制问题。

最近，Nogales和同事、分子生物学家、CRISPR-Cas9的联合发明人Jennifer Doudna的合作项目正是个好例子。她们都对R环十分感兴趣。很多情况下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，细胞内会形成一个由核苷酸构成的R环。Nogales等人对化脓性链球菌中的R环进行了成像，得到了近原子分辨率的结构图像，提示了Cas9酶在特定位点如何打开DNA，并使其可用于CRISPR的分子剪刀。

这项工作最突出的是科学家能快速地将功能与结构联系起来，而且他们能把成像方法结合起来。一个多世纪以来，结构生物学的首选方法一直是X射线晶体衍射法。但有些生物分子太大或太小，难以结晶，因此不能采用X射线法。而且，一些分子在发挥功能时，会发生形态或朝向的变化，而结晶法无法捕捉这些变化。

现在，科学家拥有一个庞大的成像工具库。低温电子显微镜或化学家的核磁共振（NMR）成像等方法，都能在不结晶的情况下，获得接近原子分辨率的结构图像，从而揭示分子的形状、大小和方向。但并非所有方法对活细胞内的全部蛋白质、核酸都有用。

经验证明，没有一个单一的方法足以探讨细胞中发生的动态行为和复杂的相互作用。最好的解决办法是整合来自多个工具的图像。

这种方法得到了诸多追随者。斯坦福大学结构生物学家Roger Kornberg指出，每个方法都能提供一些重要信息，结合起来，就能实现1+1>2的效果。由于在揭示基因转录机制方面的贡献，Kornberg于2006获得了诺贝尔化学奖。对于这一突破性研究，他使用的是X射线晶体衍射法。现在，和其他晶体学家一样，他开始使用多种方法的结合。

Kornberg继续分析RNA聚合酶II，但现在他把冷冻电镜和晶体学技术结合起来。与晶体技术相比，冷冻电镜可用于不易结晶的生物分子，并且能解析较大的分子，但目前分辨率则稍逊一筹。Kornberg实验室还使用化学交联和质谱法，揭示邻近蛋白质之间的关系以及利用已知蛋白质信息进行同源性建模。

同时，Nogales和Doudna团队也使用混合方法研究R环。Nogales表示，“高分辨率的X射线晶体法无法解析完整的R环结构。”所以他们用冷冻电镜在低分辨率上对完整的环结构进行解析。只有把两者结合起来，研究人员才能真正揭示CRISPR-Cas9中R环的作用。

这种混合或综合性方法有助于研究人员深入研究基础科学问题，对药物开发者也非常有用。细胞膜上的大蛋白质往往是治疗靶标，高分辨率混合方法能揭示药物与受体相互作用的原子细节。同样，通过展示艾滋病病毒、埃博拉病毒和其他病原体的包膜蛋白与免疫细胞相互作用机制，能有助于疫苗发展。纳什维尔范德堡大学结构生物学家Jens Meiler表示，这些结构对人们理解免疫系统的工作机制非常重要。

Noglaes总结到：“这是混合方法的黄金时代。”

梦想成真

德国欧洲分子生物学实验室(EMBL)细胞生物和生物物理部主任Jan Ellenberg表示，这个时代对很多生命科学家来说，是梦想成真的时代。这个梦想是从原子层面无缝衔接到细胞层面。针对细胞大分子的深入理解自然能解答结构生物学的首要问题：一个分子的结构是怎么和其功能联系在一起的?

结构生物学家工具箱中的每种技术都提供了不同的视角。生物学家相信，使用混合方法构建的模型可以准确地反映分子或复合体在细胞中的行为。Meiler说：“你需要把这些技术结合起来，才能得到全面答案。”

X射线晶体衍射一直是确定蛋白质原子结构的标准方法。在成立于1971年的蛋白质数据银行拥有的大约12万个模型中，约有90%来自晶体学研究。

不过，对于结构生物学家而言，该技术虽然分辨率高，但也有局限性。首先，样品要高度纯化，以产生有序的晶体。科学家通过分析原子如何散射光确定分子结构。该技术需要有足够的原子，以产生可测量的衍射图案，并且每一个晶体必须是静态的。因此，该方法不能揭示一个分子是如何运动的以及如何起作用的，也不能揭示它如何与其他系统互动。

德国复杂系统研究所计算结构生物学小组组长Gunnar Schroder指出，蛋白质不仅仅是一个单一的静态结构，“通常情况下，你想看到的是整个蛋白质如何工作”。Schroder使用混合方法理解蛋白的行为和彼此间的联系。晶体技术能提供蛋白在脱离正常环境时的快照。但结构生物学家需要其他方法补充晶体结构信息，并提高他们对蛋白质形态和功能的理解。

此外，许多蛋白质，例如细胞膜上的药物靶点，是灵活而不稳定的。为了让这些蛋白质形成晶体，研究人员经常要在某种程度上改变它们。Meiler指出，改变样本可能无法准确反映分子的原生态以及其在细胞内的排布方式。他把实验和计算方法结合，以便更好地理解分子结构。“晶体法是很好的初始方法，但这个方法不足以提供功能方面的信息。”他说。

帮个小忙

Nogales等人使用的混合策略达到了10埃的整体分辨率，相比于以往分析的30埃分辨率是极大的进步。分辨率的提高带来了新视角，正如Nogales所说，“我们可以看到氨基酸与DNA的相互作用”。

但冷冻电镜要求标本被冰冻。这并不理想，因为冷冻的样本远远脱离了自身动态、天然的状态。而核磁共振光谱可以解决这个问题。Schroder表示，“核磁共振有一个很大的优势，你可以在室温下观察样本，蛋白质的动态信息。”他的实验室通过整合NMR、冷冻电镜和晶体学数据，建立实验模型。

NMR于20世纪40年代被首次应用到实验中。研究人员在外部磁场中激发原子得到大分子结构。当原子恢复后，其内部磁场的变化可以被检测到，从而反映出分子的原子结构。然而，核磁共振光谱只适用于相对较小的大分子或复合体。

结构生物学家也使用混合方法解析超大复合体——这是过去无法完成的任务。Kornberg最新的成果进一步拓展了其对RNA聚合酶II的研究，并使用混合方法描述了一个由50多个蛋白质和转录因子组成的巨大复合体。“通过多个方法的结合，他们首次看到了整个复合体。每个方法的贡献同样大。”他说。

仍有缺点

虽然不同的方法能带来更多信息，但混合也会造成错误的叠加。因此，混合方法的一个潜在问题是，多个错误来源造成的误差增加。Meiler指出：“我关注的是如何在整合方法的同时，减小误差，保证得到的模型具有准确性、精度和可靠性。”

另一个障碍是多类数据集的共享和利用。任何一个技术都能得到丰富的信息，因此信息共享是个挑战。冷冻电镜生产商FEI公司的首席科学家Jeffrey Lengyel表示，“每天都能生成百万兆字节的数据”。他希望，结构生物学领域可以向高通量的遗传生物学领域学习处理数据超载的方法。虽然有能灵活结合高分辨率晶体结构数据和冷冻电镜图的软件，但其他方法得到的数据无法简单地混合。例如，电子顺磁共振光谱测量高分子的距离和方向，而冷冻电镜产生密度图。虽然这两种数据结合在一起非常有用，但这两种数据语言并不相同。Meiler提出疑问，“我如何整合这些数据，如何分享?”

为了探讨数据组织、共享和使用的最佳方式，几十名结构生物学家于2014年10月齐聚英国欧洲生物信息研究所。Schroder表示，目前，PDB存储单个蛋白结构的数据，应该增加蛋白质所有方面的数据。细节越丰富，越有助于全面解析蛋白和大分子功能。

学界已经做出了一些努力：目前已建立二维电子显微镜图像档案库和三维的EMDataBank。这些档案库由EMBL等机构提供资金，其中包含的数据可以共享、归档和分发。

另一个可能阻碍该领域的威胁是专业知识。Meiler指出，“技术需要投资，但在培训科学家上进行投入也非常重要。”他建议，结构生物学领域的学生都去学习每一种方法的优缺点，并至少精通一种方法。“我们需要培养新一代科学家理解如何整合这些不同的技术。”

最后，结构生物学家必须学会提问题，提出新的、复杂的、以前被认为不可能的生物问题。Ellenberg还表示，多亏混合方法，“很多5年前我甚至以为直到退休都没法探索的问题能解决了