链霉亲和素强结合小分子生物素是目前最流行的非共价偶联方法之一，二者的相互作用也是已知的最强的非共价作用。链霉亲和素可以偶联至磁珠、琼脂糖基质等各类载体上，成为高特异性的亲和介质，捕获生物素标记的各类配体，使目标物插翅难逃。另外，荧光标记的链霉亲和素还广泛用于各类荧光检测实验。跟着小 M 一起来看看链霉亲和素-生物素系统的各种实际应用吧~~~
链霉亲和素 (Streptavidin/SA，分子量≈65 kDa，等电点≈6.0)，是从链霉菌 Streptomyces Avidinii 培养物中提取的一种分泌性蛋白质。链霉亲和素是四聚体蛋白，也是一种生物素结合蛋白，包含四个亚基，每个亚基都有一个生物素结合位点。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合 (图 1)，二者的解离常数 (kd) 约为 10-15，这种紧密而特异的结合非常快速且能够承受极端的 pH 值、温度、有机溶剂和变性试剂。
链霉亲和素总体电荷的适中性特点大大减少了与其他分子的静电相互作用，从而降低链霉亲和素的非特异性结合。同时，链霉亲和素不是糖蛋白，不与糖类受体结合，使得链霉亲和素-生物素系统 (Streptavidin-Biotin System,SABS) 比亲和素-生物素系统 (Avidin-Biotin System,ABS) 的在实际应用上具有非特异性吸附更少、背景更低、信噪比更好等优势。因此 SABS 广泛应用于免疫沉淀 (IP)、蛋白纯化以及成像实验的信号放大，如免疫荧光 (IF)、酶联免疫吸附实验 (ELISA)、原位杂交等实验。
链霉亲和素可以偶联至磁珠、琼脂糖基质等各类载体上，成为高特异性的亲和介质，捕获生物素标记的各类配体。MCE 链霉亲和素磁珠在涉及多种应用的 64 篇文献中被引用 (累计影响因子 360+)，如免疫沉淀 (IP)、染色质免疫共沉淀 (CHIP)、RNA pull down、蛋白纯化等。
▐ 案例 1：免疫沉淀 (IP)
为了证实 Rab11a 是否在缺氧条件下的 MSC-sEV (间充质干细胞来源的小细胞外囊泡)回收中发挥作用，作者使用了链霉亲和素磁珠共沉淀生物素标记的 MSC-sEV 及其在 NPC (髓核细胞) 中的相互作用蛋白，而阴性对照组设置为未标记的 MSC-sEV。ALIX 是一种常用的 sEV 标记物，用于检测免疫共沉淀的 MSC-sEV。作者发现在常氧组和缺氧组中，Rab11a 均被链霉亲和素磁珠共沉淀，但在生物素化的 MSC-sEV 或 NPC + 未生物素标记的 MSC-Sev 组中则不然，这表明缺氧下 Rab11a 与内化 MSC-sEV 之间的相互作用增强 (图 2)。
图 2. 缺氧下 Rab11a 与内化 MSC-sEV 之间的相互作用[1]。
▐ 案例 2：染色质免疫共沉淀 (CHIP)
作者假设 CnHsf3 可以通过 DNA 结合域 (DBD) 的直接氧化来激活。为了验证这一假设，作者使用三种生物素标记的 CnHsf3-线粒体靶向寡核苷酸进行 CHIP 实验。结果表明，经 NaClO (氧化剂) 处理的 CnHsf3 DBD 与所有靶寡核苷酸结合，而未经处理的 CnHsf3 DBD 则表现出未结合或有限结合 (图 3)。进一步的 EMSA 与 SPR 实验也证实了 CnHsf3 DBD 与线粒体靶向寡核苷酸探针互作，表明 CnHsf3 的功能与其 DBD 的氧化相关。
图 3. CnHsf3 DBD 与线粒体靶向寡核苷酸探针互作分析环[2]。
▐ 案例 3：RNA 免疫沉淀 (RIP)
作者假设 YTHDC1 参与 HaCaT 细胞中 SQSTM1 表达的调节。RNA 免疫沉淀 (RIP)-qPCR 实验表明，YTHDC1 蛋白可以与 SQSTM1 mRNA 相互作用。RNA 亲和分离(RNA affinity isolation)，进一步证实了 SQSTM1 mRNA (已生物素化处理) 与YTHDC1 蛋白相互作用 (图 4)。
图 4. 正常葡萄糖处理的 HaCaT 细胞中 YTHDC1 蛋白和 SQSTM1 mRNA 的互作分析[3]。
Tips：如何从链霉亲和素磁珠上解离生物素分子？
链霉亲和素-生物素相互作用是已知最强的蛋白与其他分子间非共价的生物相互作用。许多应用不需要从链霉亲和素磁珠上解离生物素分子，如上述的 3 个案例。如需要解离，通常情况下都需要非常剧烈的方法 (此时链霉亲和素已变性)。下述为 2 种方法举例：
1）解离生物素化核酸：为了从链霉亲和素磁珠上分离生物素化核酸，在 pH 8.2 的 95% 甲酰胺+ 10 mM EDTA 中孵育磁珠，65°C 孵育 5 分钟或 90°C 孵育 2 分钟。使用磁力架将磁珠吸到试管壁上，将含有生物素化核酸的上清液从试管中取出。
2）解离生物素化蛋白质：对于生物素化蛋白质，则可在 0.1% SDS 或 SDS-PAGE 缓冲液中煮沸磁珠 3 分钟。
一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，从而放大弱信号，通过简单的工作流程即可提高细胞或组织内中低丰度目标的检测灵敏度。链霉亲和素可以与多种荧光染料/报告标签结合，同时生物素标记抗体、酶的标记率高且不影响蛋白的活性，因此链霉亲和素-生物素系统可用于几乎所有的免疫测定实验。这些优点使链霉亲和素-生物素标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。
例如，荧光标记的链霉亲和素，如 Vari Fluor 488-Streptavidin，广泛用于细胞表面标记、荧光细胞分选 (FACS) 和其他荧光检测成像应用。
图 5. Vari Fluor 488-Streptavidin 的免疫荧光染色。
除 Vari Fluor 488-Streptavidin 外，MCE 还可以提供多种 Vari Fluor 染料标记的链霉亲和素。这些 Vari Fluor 染料的发射光谱覆盖整个可见光和近红外光，在多色标记实验中能够很容易地进入细胞核和胞质结构并标记靶蛋白，进行成像和分析。
参考文献：
[1] Bide Tong, et al. Augmenting Intracellular Cargo Delivery of Extracellular Vesicles in Hypoxic Tissues through Inhibiting Hypoxia-Induced Endocytic Recycling. ACS Nano. 2023 Feb 14;17(3):2537-2553.
[2] Xindi Gao, et al. Cryptococcal Hsf3 controls intramitochondrial ROS homeostasis by regulating the respiratory process. Nat Commun. 2022 Sep 15;13(1):5407.
[3] Diefei Liang, et al. m6A reader YTHDC1 modulates autophagy by targeting SQSTM1 in diabetic skin. Autophagy. 2022 Jun;18(6):1318-1337.