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逆转录实验做不好,是不是引物出了问题

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2020-04-09T00:00 (访问量:3027)

 

逆转录实验做不好,是不是引物出了问题

 

实验室常用到的实验:逆转录实验
实验人员通过体外模拟病毒复制过程,以提取的RNA为模板,使用逆转录酶催化,合成出与RNA互补的cDNA链。最终构建cDNA文库,并从中筛选所需的靶标基因。



BUT!小伙伴们做逆转录实验时,
1)有没有深究过RNA逆转录出的cDNA能不能真实反映出基因表达信息?
2)做实验时,有没有发生过内参做的很好,目的基因做不出的情况?
如果有发生上述情况,那么需要重新评估逆转录实验结果的有效性。

逆转录结果有效性的评定
逆转录实验结果有效性的评定最重要的是尽可能反映样本中原始RNA模板的信息,即均一性地将RNA逆转录生成cDNA。理论上来讲,不考虑碱基组成的影响,均一性体现在不同位置处的片段同等效率地合成cDNA,进而保证真实地反映转录谱中不同基因的实际丰度。
逆转录实验的成功与RNA模板、逆转录酶、引物及反应程序等有关。当我们实验做不成功时,大家会优先从模板、逆转录酶来找原因,往往忽略引物在其中起的作用,其实引物对逆转录成败也至关重要。
今天小翊就跟大家讨论下逆转录引物的分类和选择。

逆转引物的分类和选择
逆转录引物有三类,Oligo dT引物、随机引物、基因特异性引物(GSPGene Specific Primer)。
1Oligo dT引物:
若干dTTP组成的引物,可以和真核生物mRNAPoly A尾配对,与模板结合特异性高。因该特异性,常适用于获取转录本靠近3’末端序列。它不适用于降解的RNA模板,也不适用于缺少A尾的RNA,如原核生物RNAmiRNA。当RNA模板降解时或RNA内部中有复杂二级结构时,会造成cDNA合成长度变短,无法有效合成靠近RNA 模板5’末端的序列。这是影响均一性的常见因素。
也常见Oligo dT序列的3’端存在几个锚定碱基,如常见的miRNA加尾法逆转录引物。

2)随机引物
随机引物是若干个碱基组成的寡核苷酸,如随机六聚体,5’-dNNNNNN-3’,是各种引物的混合物。它与模板结合的特异性低,可在整个转录本的多个位点退火,产生短的、部分长度的cDNA。常适用于获取转录本5’末端序列及二级复杂结构的区域。一般不建议用于长片段序列的合成。有文献报道15个碱基的随机引物比6碱基和9碱基随机引物转录出的cDNA产量和基因丰度更高[1]
3)基因特异性引物(GSP
基因特异性引物(GSP)也即是反向引物,是与模板序列互补的引物,需要实验者根据实验需求自己设计合成,适用于目的序列已知的情况。若做一步法RT-PCR,只能用GSP引物。设计GSP的原则同PCR引物相同。
若研究真核基因时,可将Oligo dT与随机引物混合使用,集二者之长,得到的cDNA均一性更好。实验重复性也更高。
对三种引物有初步了解后,针对一些实验中遇到的问题,小翊给大家提供了实验建议。

实验建议
问题一:大鼠肝脏的RT-qPCR,逆转录用的是oligo dT引物,PCR时内参出的很好,就是目的基因不出,已经差不多一个月了。怎么办?
小翊建议:根据Oligo dT引物介绍,具有明显二级结构的RNA也会破坏全长cDNA的合成,造成RNA 5’末端的代表性下降。同样的,RNA模板出现降解时,也会造成Oligo dT全长cDNA合成能力的下降。建议使用Oligo dT/随机引物的混合物作为逆转录启动引物。
问题二:RNA模板有降解怎么办?
小翊建议:尽量选用RNA质量好的样本,但是如果条件不允许,建议用随机引物,适合poly A比较短或被降解的情况做逆转录。
问题三:RNA病毒研究用什么引物?
小翊建议:在RNA病毒的研究中一般用随机引物和基因特异性引物。一方面是病毒RNA没有PolyA的原因。另一方面,当复杂二级结构较多时,使用基因特异性引物有利于提高退火温度,打开二

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