实时定量PCR（qPCR）是基因表达研究中不可或缺的技术手段，通常包括反转录（RT）和定量PCR（qPCR）两个核心步骤。根据操作流程的不同，qPCR可分为一步法和两步法两种策略。那么在实际操作中，我们该如何在这两种方法中进行选择呢？
01 一步法：高效简洁，适合高通量单基因分析
一步法将反转录与qPCR置于同一反应管中进行，直接以RNA为模板启动反应。
图 一步法qPCR示意图
优点：
高效便捷：操作简便，加样次数少，有效降低污染风险。
操作简单：方法设置快速，扩增少数靶标基因时，可以轻松处理多个样品；尤其适用于多样本中同一基因的表达检测。
高灵敏度：一步法直接对cDNA进行扩增，灵敏度更高，能够检测到极微量的RNA，使研究者能够捕捉到微小的基因表达变化。
局限：
模板要求高：对RNA模板质量要求较高，模板质量优劣严重影响逆转录效率。
反转录产量较低：一步法反转录使用基因特异性引物，而两步法使用Oligo dT和Random Primer作为引物，一步法反转录产物低于两步法。
引物异常：上下游基因特异性引物易形成引物二聚体，干扰后续荧光定量。
酶活抑制：DNA聚合酶酶活受到逆转录体系中某些组分的抑制，影响扩增效率。
尽管通过酶改造与体系优化，目前的一步法试剂已在兼顾两种酶活性方面取得显著进展，但仍需谨慎评估实验条件。
02 两步法：灵活通用，适合多基因检测与珍贵样本
两步法先将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行qPCR，实现对RNA的间接定量。
图 两步法qPCR示意图
优点：
反转录产量高：反转录产量高于一步法，对RNA起始量适应范围宽。
产物应用广泛：中间产物 cDNA 能够建立可以长期保存，用于克隆、建库等其它用途。
多基因检测：可实现高通量多基因检测。
便于条件优化：每一步可独立优化反应条件，灵活性更高，可以在困难的PCR情况和靶标丰度可变时进行调整。
酶活不受限：该方法将RT和qPCR两种酶促反应分开进行，更便于RT Enzymes和DNA Polymerase酶活性的释放。
局限：
繁琐耗时：操作步骤较多，耗时较长。
误差风险：多次移液可能增加污染和操作误差的风险。
03 如何选择？
如果你需要对大量样本中的单个基因进行快速检测，推荐使用一步法，它适合使用经过充分测试的引物进行优化反应的高通量鉴定。
如果你需要对同一样本中的多个基因进行表达分析，或RNA样本量比较珍贵、质量不高，靶标没有得到充分验证可能需要返回测试新靶标，又或者后续还需利用cDNA进行其他实验，则两步法是更合适的选择。
理解两种方法的原理与适用场景，结合实际实验需求与样本条件，才能做出最明智的决策，保障科研结果的准确与可靠。
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