热的受不了的高温假来啦，你的细胞会选择什么样的方式入眠静等高温假后复苏呢？

细胞冻存是一项重要的实验技术，冻存的不好，三天复苏死光光，冻存得当在液氮里放个5-10年都没有问题，那么细胞冻存需要注意什么呢？

1. 细胞状态：

   - 确保细胞状态良好，生长平稳，成对数生长，无污染、形态良好没有变异。

   - 选择汇合度80%-90%左右。处于生长平顶期的细胞进行冻存操作，以确保细胞在冻存时状态最佳。

- 若细胞进行支原体查杀或者慢病毒感染 ，细胞应传两代直到生长对数稳定后再进行冻存。

                                                               免程序冻存液-低血清（启达生物，货号：SD0001)

2. 冻存液的选择：

这个过程很重要，细胞在休眠的时候也会需要少量养分和抗氧化物质，因此正常的冻存液配制，我们都会选择90%FBS+10%DMSO来冻存细胞，冻存液最好不要现配现用，提前一天配制放4°过夜，据说可以给DMSO去热源，细胞冻存后我们选择程序降温即可（方法见下文细胞的程序降温）.

启达生物的低血清冻存液（启达生物，货号：SD0001)更加让细胞冻存更加方便：

它无需程序降温，细胞冻存后直接放入-80°过夜，24小时移入液氮即可，

它含有2%的血清，含有抗氧化剂和细胞休眠时所细胞的蛋白质和氨基酸，

它只含有5%DMSO,因为DMSO一旦浓度过高会导致细胞在冻存时中毒，复苏细胞存活少，或者长时间不长。

启达生物无血清无蛋白冻存液（启达生物，货号：SD0002）适用于限制血清干扰的细胞冻存:

它采用氨基酸和维生素替代了血清和蛋白组分，研究发现，IPS或者其他多能干细胞，血液细胞等在含有FBS的环境下长期冻存，复苏后会出现分化现象，因此在这类细胞的冻存中，我们都建议使用无血清无蛋白组分的冻存液，以维持细胞在休眠时的营养所需.

它也无需程序降温，冻存后直接放-80°过夜 ，在-80°冰箱细胞可保存1-2个月。

A-375冻存6个月后复苏24小时形态：

                                                                    其他品牌冻存液

                                                                 启达生物免程序无血清冻存液（SD0002）

3. 细胞冻存过程：

   - 冻存管的管盖并不是拧得越紧越好，因为管盖内有O型橡胶圈，拧得太紧会让其变形，造成泄漏。当然，太松也会泄漏。

   - 冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。

- 冻存细胞不宜密度过大，一般肿瘤细胞株的冻存在1*10^6cell/ml， 巨噬细胞需要1.5-2x10^6cell/ml。神经细胞冻存时因为细胞个头比较大，通常不好估计数量，而神经细胞复苏的死亡也很高 ，建议冻存数量在1*10^6cell/ml以上。

                                                      免程序冻存液无血清无蛋白（启达生物，货号：SD0002）

4. 细胞程序降温：

   - 采用“慢冻快融”的方法，标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

   - 如果没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存。

若使用的是免程序降温冻存液，可省略这一步鄹。

5. 长期保存：

   - 细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

   - 冻存细胞长期保存应放置于液氮，不建议在-80℃长期保存，-80°长期保存会让您的细胞复苏存活和状态都大打折扣。

细胞冻存完成，趁高温假好好给自己放个假吧