2017年可谓是CAR-T细胞疗法元年，Novartis的Kymriah和Kite（Gilead）的Yescarta两个细胞治疗药物相继在2017下半年被FDA批准，将这一疗法实现产业化，给全球的癌症患者带来了希望。CAR-T药物的异军突起也得到了资本市场及传统药企的广泛关注，自2012年以来涉及CAR-T药物的资本并购总额超过数百亿美金，同时全球超过300多项临床正在进行。
基于CAR-T药物广阔的市场前景，远在大洋彼岸的中国也正在寻求以CAR-T疗法为代表的细胞免疫治疗产业化突破。2017年12月22日，CFDA发布《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》，为我国细胞治疗产品作为药品属性的规范化产业化生产拉开序幕。截止目前，短短两个月内，在CFDA进行临床试验申请的CAR-T药物即超过13个，同时中国在CAR-T领域的探索性临床研究项目已超过130项，占全球免疫治疗细胞治疗临床研究的1/3，仅次于美国。
▲国内CAR-T药物临床试验申请概况▲
虽然近几年来，CAR-T药物在安全性和有效性上取得了极大的突破，得以推向市场造福患者，但是居高不下的药品价格（Kymriah:47.5万美元，Yescarta:37.3万美元）仍然让大部分患者望而却步。CAR-T药物生产涉及环节多、生产周期长以及安全性要求高是其售价居高不下的主要原因。而CAR-T药物由于其转化医学的鲜明特点，其产业化道路才刚刚起步，充满无限的挑战，CAR-T药物的研发人员无不感叹CAR-T药物生产技术将是其真正走向产业化最关键的因素。
同时由于CAR-T药物工业化道路才刚刚起步，相关工艺与其它产品相比更为神秘。为了更好的促进CAR-T药物的工业化生产，本文将公布的CAR-T药物生产工艺进行总结，可以看到的是探索中前进的CAR-T药物生产技术将逐步实现生产流程标准化和规范化，更多安全有效的产品将脱颖而出。
小编插播一句：文末有福利哦~
探索中前进的CAR-T药物生产技术
CAR-T疗法是一种基于整合了CAR基因的自体或异体T细胞疗法，其整个生产工艺流程包括采血、分离、激活、转染、扩增、制剂、放行、运输和给药等一系列过程。
▲自体CAR-T药物生产流程▲
这些生产环节分布于不同机构与组织，通常采血在医院进行，随后采取的外周血发送至生产基地进行核心的CAR-T药物生产，生产放行后的CAR-T药物再进一步通过冷链运输返回至医院供病人注射。对于更常见的自体T细胞疗法，加上质量检测整个生产工艺流程通常为30天左右，这对于处于晚期的病人来说这样的周期长度仍然偏长。各个研发单位基于自身工艺的区别，其生产周期也长短不一，不过生产周期随着技术的技术的进步正在不断缩短。
Kite的工艺更为简便，其生产周期也最短，仅为10天左右。Novartis的生产周期更为复杂一些，其生产周期更长一些达到了29天，虽然Novartis后期进行过一些优化，但仍然有22天。但Novartis生产工艺目前被认为是比较标准的CAR-T药物生产工艺，其生产工艺的稳定性也得到了充分的验证，在Novartis关键性的临床试验B2202中的78例病例中，只有6例病人因为生产原因（4例因为T细胞未能成功生长，1例因为药物剂量低于质量标准，1例因为残留磁珠高于质量标准）未能进行药物注射。Juno虽然没有公布其精确生产周期，但是也透露在14-18天左右，同时基于其前期的临床试验结果不太理想，对其生产工艺进行了充分的优化，率先使用了CD4和CD8等比例的T细胞源进行生产，极大地保证了药物的有效性，Juno透露其第三代和第四代技术目标将缩短至3-6天。
▲CAR-T药物研发**企业工艺流程▲
从目前来看，整个CAR-T药物的生产技术对于仪器的依懒性还是比较高的，也就是选择怎样的生产仪器即决定了怎样的生产工艺。但对于CAR-T药物的生产工艺两项基本原则是：封闭的及可重复的。近年来，各个设备提供商们也极大地推动了自身设备的研发，为每个CAR-T单元生产环节提供解决多种方案。同时还提供了整理解决方案的设备，例如CliniMACS一款仪器可以实现从细胞筛选到最终制剂制备的整个T细胞生产工艺，当然其售价及后期使用价格也更为高一些。但无论基于怎样的设备考量，每个生产环节的目的仍然是一样的。
▲CAR-T药物单元操作流程▲
首先，T细胞疗法从体内全血中获得患者的白细胞。通常在采集过程中会加入抗凝剂，使用密度梯度介质连续或间断离心法分离血液成分。采集过程中，仍然会有少量红细胞和血小板会残留在收集的白细胞中，红细胞会影响最终T细胞药物的效率，血小板会引起细胞聚团，而抗凝剂有可能会改变细胞的生化特性，因此在采集后的白细胞首先要进行淘洗。Ficoll梯度离心是最常用的分离方式，但是其由于是非封闭的系统而逐渐被淘汰。自动淘洗装置COBE 2991 Cell Processor，Haemonetics CellSaver ，Biosafe Sepax II以及CaridianBCT Elutra单细胞采集器等仪器使用越来越常见。
淘洗后的T细胞根据工艺的要求会进一步进行富集，有的需要CD4和CD8等比例，有的需要采集CD56或者CD3阳性的T细胞，目前有通过抗体磁珠、细胞大小或者流式细胞仪等多种特异性的细胞富集方式。
在体内，T细胞主要依靠树突状细胞（DC）等抗原呈递细胞的分化刺激T细胞增殖。通过如CD28、4-1BB，OX40共刺激分子，T细胞被T细胞受体（TCR）与位于DC细胞表面的主要组织相容性复合体相互作用所激活。在体外培养过程中，为了避免与DC同培养的过程的繁琐过程，有几种方法模仿天然T细胞激活过程已经开发并实施。最早方法是抗CD3抗体和IL-2的联合使用，或许又有方法将抗CD3抗体、抗CD8抗体以及IL2三者进行联用激活，接着Invitrogen和Miltenyi分别开发的CD3/CD28抗体磁珠极大地提高了激活效率，目前以抗体磁珠为代表的激活方式占到了60%以上。
T细胞进行激活以后，就需要将其改造成注射到体内的形式，这一步将是整个CAR-T药物生产工艺的核心。目前最常用方式是通过病毒转染方式进行T细胞改造，这其中又以逆转录病毒和腺相关病毒的转染方式更为普遍，两者占到了所有转染方式的90%左右。逆转录病毒技术更为传统，其安全性高、生产成本也更低一些。但腺相关病毒基于其转染效率高的特点，使用比例正在不断增加。同时由于病毒载体的生产和质量控制也极为复杂，目前大多数细胞治疗的病毒载体都是外包生产。基于安全性方面的考虑，转座子电转等一些转染方式也逐渐得到关注，但是其转染效率仍然有比较大的限制。另一方面，ZFN、TALEN和CRISPR等一些基因敲除的改造方式也逐步运用到异体T细胞治疗中。
▲基因转染方式比较▲
改造后的T细胞，下一步就需要培养到足够的数量以输送到病人体内，这是整个T细胞药物生产的另一个关键步骤，目前最常用的三种方式为静置的方瓶培养、透气式的培养袋培养以及摆动的反应器培养，这些培养根据最终需要的T细胞数量可以灵活选用合适的培养方式。目前大多数T细胞药物剂量为10e8-10e9个，因此传统静置越来越难以满足培养要求，以Xuri为例的摆动的反应器培养方式因为更高细胞密度和更短的培养时间，逐步应用到T细胞的生产中，占有比例达到40%以上。
近来，《Current Opinion in Biotechnology》上的一篇文章，通过对2002至2017年9月以来所有公布的CAR-T药物生产工艺，综合来看，约有19%的采用抗体IL2联合激活+病毒转染+方瓶扩增的工艺，约有18%的采用抗体IL2联合激活+病毒转染+培养袋扩增的工艺，还有43%的采用抗体磁珠激活+病毒转染+方瓶摆动反应器扩增的工艺，这也体现了在不断探索中前进的CAR-T工艺。
▲CAR-T药物关键生产工艺概况▲
然而对于整个CAR-T生产工艺却没有结束，还需要有一系列的质量检测。以CAR-T CD19为例，目前对最终产品外观、安全性、纯度、杂质、鉴定、数量及活性方面进行一系列的控制，药物的T活性要高于70; 21CFR610.12中14天的无菌检测法至少保证第七天仍是阴性；内毒素要求为5 EU /Kg/h；CD19的B细胞含量应低于2%。
▲CAR-T药物质量控制▲
自体T细胞疗法的每个产品都是独立批次，为保持CAR-T批间质量一致，对CAR-T生产的每一步实施质量控制十分必要。其中，CAR表达水平作为CAR-T质量控制的重要参数之一，通常通过流式细胞术检测CAR阳性T细胞占总T细胞的比例来评估，即CAR阳性表达率，目前要求为不低于15%。同时必须强调的是所有最终CAR-T药物的剂量都是阳性T细胞来计数的，所以CAR-T细胞的阳性检测十分关键，笔者在此分享几个案例。
案例一、Anti-BCMA CAR表达阳性率检测
案例来源：深圳普瑞金生物药业公司
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BD FACSCalibur流式细胞分析仪
样本信息：转染anti-BCMA CAR的人原代T淋巴细胞
主要试剂：
生物素标记的hBCMA蛋白（Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17Protein，Fc Tag，Avi Tag（AvitagTM），ACROBiosystems，Cat.No.BC7-H82F0）；
PE标记的链霉亲和素（PEStreptavidin，Biolegend，Cat.No.405204）；
简要流程：
1. 将anti-BCMA CAR基因通过慢病毒质粒转染，整合到来自患者的自体T细胞基因中；
2. 利用anti-BCMA CAR特异性结合BCMA蛋白的特性，将生物素标记的hBCMA蛋白（ACROBiosystems，Cat.No.BC7-H82F0）标记到anti-BCMACAR-T细胞表面；
3. 利用生物素特异性结合亲和素的特性，将PE标记的链霉亲和素（Biolegend，Cat.No.405204) 作为荧光二抗，标记到anti-BCMACAR-T细胞表面；
4. 用BD FACSCalibur流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示1号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在52.72%，2号患者anti-BCMA-CART细胞阳性率在73.49%。
Human T cells were transfected with anti-BCMACAR and cultured for 3 days. Three days post-transfection, 1x10 6 cellswere first incubated with 50ul biotinylated human BCMA protein(Cat.No. BC7-H82F0, 8ug/ml ), washed and then stained with PE Streptavidinand analyzed by flow cytometry. (Data are kindly provided by PREGENE Biopharma)
案例二、Anti-CD19 CAR表达阳性率检测
案例来源：ACRO公司应用开发团队自主研发
检测方法：流式细胞术
检测仪器：NovoCyteTM Flow Cytometer,ACEA Biosciences
样本信息：R1013-C6细胞（过表达Anti-CD19[FMC63]scFv & RFP的Expi 293细胞）
主要试剂：
生物素标记的hCD19蛋白（Biotinylated Human CD19，Fc Tag,ultra sensitivity （primary amine labeling），ACROBiosystems，Cat.No.CD9-H8259）；
FITC标记的链霉亲和素（FITC Streptavidin，Biolegend，Cat.No.405201）；
简要流程：
1. 将Anti-CD19[FMC63] scFv& RFP基因通过质粒转染，整合到Expi 293细胞基因中，命名为R1013-C6细胞；
2. 利用anti-CD19[FMC63]scFv特异性结合CD19蛋白的特性，将生物素标记的hCD19蛋白（ACROBiosystems，Cat.No.CD9-H8259）标记到R1013-C6细胞表面；
3. 利用生物素特异性结合亲和素的特性，将FITC标记的链霉亲和素（FITC Streptavidin，Biolegend，Cat.No.405201)作为荧光二抗，标记到R1013-C6细胞表面；
4. 用NovoCyteTMFlow Cytometer流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示生物素标记的CD19蛋白能够与 R1013-C6细胞膜表面的anti-CD19 [FMC63]
293 cells were transfected with FCM63-scFv andRFP tag. 2x105 of the cells were first incubated with A.Biotinylated protein control. B. Recombinant biotinylated human CD19 (Cat. No.CD9-H8259, 10ug/ml). C. Recombinant biotinylated human CD19 (Cat. No.CD9-H8259, 10ug/ml) and FMC63 (Mouse anti-CD19 antibody), followed by FITCStreptavidin, and then analyzed using NovoCyteTM Flow Cytometer. RFP was usedto evaluate CAR(FMC63-scFv) expression and FITC was used to evaluate thebinding activity of recombinantbiotinylated human CD19 (Cat. No. CD9-H8259).
ACROBiosystems
ACROBiosystems作为专注于医药研发领域的蛋白供应商，利用专业的蛋白研发平台和生物素标记平台，开发了一系列CAR-T靶点蛋白，助力CAR-T疗法的开发，其中生物素预先标记的蛋白在Biopanning筛选scFv，以及流式细胞技术检测CAR表达和筛选CAR表达的细胞中独具优势。目前产品已覆盖BCMA，CD19，ROR1，EGFRVIII等20余个CAR-T热门靶点。如果您有其他相关案例分享或者对以下某个案例细节感兴趣，请联系cart@acrobiosystems.com。
ACRO CAR-T靶点蛋白产品列表
| BCMA | CAIX | CD138 | CD19 | CD20 |
| CD22 | CD30 | CD33 | CD38 | HGFR |
| EGFR | EGFRVIII | EpCAM | FOLR1 | GPC3 |
| HER2 | IL13Rα2 | MSLN | MUC1 | ROR1 |
* ACRO CAR阳性表达率检测方案合作开发项目进行中，CAR-T靶点蛋白免费领，更有礼品等您来拿，点击“CAR阳性表达率检测方案”查看详情；
展望
CAR-T药物虽然历经几十年的发展，但是工业化的道路近几年才慢慢走通，底子相对还很薄。同时如上所述，基于其转化医学的鲜明特点，其在工业化生产方面仍然还存在不少难点和痛点，挑战重重。但是无论怎样，治病救人，安全质量仍然需要考虑到第一位，必须逐步实现生产的流程标准化和规范化，严格做好CAR-T药物的质量控制。
参考文献
1. Vormittag P, Gunn R, Ghorashian S, et al. A guide to manufacturing CAR T cell therapies[J]. Current opinion in biotechnology, 2018, 53: 164-181.
2. Piscopo N J, Mueller K P, Das A, et al. Bioengineering solutions for manufacturing challenges in CAR T cells[J]. Biotechnology journal, 2017.
3. Siegler S E. Autologous CAR-T Cell Manufacturing: Current Standing and Future Directions. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2017.