LP2000转染试剂

中文名称：LP2000转染试剂
英文名称：LP2000 Transfection Reagent
产品规格：0.5ml|1.5ml|5×1.5ml
本转染试剂是一种非常高效的新型转染试剂，达到了国际最主流转染试剂的转染效果。适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中，也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。对于六孔板，一个包装的本转染试剂大约可以转染100个孔；对于24孔板，一个包装的本转染试剂大约可以转染500个孔。

LP2000转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性，并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。

LP2000转染试剂的使用方法和常用的Lipofectamine 2000 Reagent完全一致。并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试，转染效率也和Lipofectamine 2000 Reagent相当甚至略高。

LP2000转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染，也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。

LP2000转染试剂转染过表达质粒后，通常24-48小时后达到较高的蛋白表达水平，并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时；转染siRNA通常3-5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。

LP2000转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。

LP2000转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。

LP2000转染试剂与Lipofectamine 2000 Reagent转染效果比较请参考图1-6。


图1.LP2000转染试剂与Lipofectamine 2000 Reagent转染效率的比较。仅转染试剂不同，其余条件一致。


图2.LP2000转染试剂(A-B)与Lipofectamine2000 Reagent(C-D)用EGFP表达质粒转染HEK293T细胞后的实拍效果图。


图3.LP2000转染试剂(A-B)与Lipofectamine2000 Reagent(C-D)用EGFP表达质粒转染Hela细胞后的实拍效果图。


图4.LP2000转染试剂(A-B)与Lipofectamine2000 Reagent(C-D)用EGFP表达质粒转染NIH3T3细胞后的实拍效果图。


图5.LP2000转染试剂(A-B)与Lipofectamine2000 Reagent(C-D)用EGFP表达质粒转染HEK293FT细胞后的实拍效果图。


图6.LP2000转染试剂(A-B)与Lipofectamine2000 Reagent(C-D)用EGFP表达质粒转染CHO细胞后的实拍效果图。

注意事项：

• 使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。对于质粒，可以使用质粒大量抽提试剂盒进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
• 转染前细胞必须处于良好的生长状态。
• 需自备不含抗生素的无血清培养液或Opti-MEM培养液或普通的DMEM培养液。
• LP2000转染试剂不能vortex或离心，宜缓慢晃动混匀。
• LP2000转染试剂使用后请立即盖好盖子，避免长时间暴露在空气中，影响转染效率。

保存条件：
4℃保存。长期不使用可以-20℃保存。

使用说明：

一、DNA转染：

• 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-90%。
• 在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清，不含抗生素)。可以使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素的存在对于有些细胞容易导致转染后出现一定的细胞毒性。
• 参考下表，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM Medium，然后于其中一管加入2.5μg质粒DNA，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入5μl LP2000转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。室温静置5分钟后(通常最长不宜超过25分钟)，将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含LP2000转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟(室温存放6小时内稳定)。
  

  	96-well	48-well	24-well	12-well	6-well	6cm dish	10cm dish
  LP2000转染试剂	0.2μl	0.5μl	1μl	2μl	5μl	10μl	30μl
  无血清培养液或Opti- MEM Medium	5μl	12.5μl	25μl	50μl	125μl	250μl	750μl
  DNA	100ng	250ng	500ng	1μg	2.5μg	5μg	15μg
  无血清培养液或Opti- MEM Medium	5μl	12.5μl	25μl	50μl	125μl	250μl	750μl
  稀释好的LP2000转染试剂和DNA分别室温静止放置5分钟，随后两者混合并混匀再室温静止放置5分钟
  每孔加入的混合物的量	10μl	25μl	50μl	100μl	250μl	500μl	1500μl
  按照上述用量每孔均匀滴加LP2000转染试剂和DNA的混合物，4-6小时后更换培养液或直接继续培养

  
  注意：
  
  • 对于六孔板中一个孔的细胞，LP2000转染试剂的用量可以在3-12.5μl范围内进行适当调节，DNA用量建议固定在2.5μg，但也可以在1-4μg的范围内进行适当调节。通常质粒用量(μg)和LP2000(μl)的用量比例为1:2或1:3比较常用，如有必要可以在1:0.5-1:5的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为1:2，此时LP2000的用量相对较少，既经济又高效。最佳的转染条件，因不同的细胞类型和培养条件而有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
  • 质粒的浓度宜控制在0.5-5μg/μl范围内。
  • 对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的LP2000转染试剂和DNA混合物分别配制，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀并孵育5分钟后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。
  • 对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。
• 无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔250μl LP2000转染试剂-DNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
• 为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养4-6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞，推荐在转染4小时后更换培养液，对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染6小时后更换培养液)。
• 继续培养约24-48小时后，即可用适当方式检测转染效果，例如荧光检测、Western、ELISA、报告基因等，或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。

二、siRNA转染：

• 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约30-50%。
• 在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清，不含抗生素)。可以使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素的存在对于有些细胞容易导致转染后出现一定的细胞毒性。
• 参考下表，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM Medium，然后于其中一管加入100pmol siRNA，并用枪轻轻吹打混匀；而另一管加入5μl LP2000转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。室温静置5分钟后(通常最长不宜超过25分钟)，将含有siRNA的培养液用枪轻轻加入含LP2000转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟(室温存放6小时内稳定)。
  

  	96-well	48-well	24-well	12-well	6-well	6cm dish	10cm dish
  LP2000转染试剂	0.2μl	0.5μl	1μl	2μl	5μl	10μl	30μl
  无血清培养液或Opti- MEM Medium	5μl	12.5μl	25μl	50μl	125μl	250μl	750μl
  siRNA	4pmol	10pmol	20pmol	40pmol	100pmol	200pmol	600pmol
  无血清培养液或Opti- MEM Medium	5μl	12.5μl	25μl	50μl	125μl	250μl	750μl
  稀释好的LP2000转染试剂和siRNA分别室温静止放置5分钟，随后两者混合并混匀再室温静止放置5分钟
  每孔加入的混合物的量	10μl	25μl	50μl	100μl	250μl	500μl	1500μl
  按照上述用量每孔均匀滴加LP2000转染试剂和siRNA的混合物，4-6小时后更换培养液或直接继续培养

  
  注意：
  
  • 对于六孔板中一个孔的细胞，LP2000转染试剂的用量可以在2.5-7.5μl范围内进行适当调节，siRNA用量可以在50-250pmol的范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和LP2000(μl)的用量比例为20:1，如有必要可以在10:1-40:1的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为20:1，此时LP2000的用量相对较少，既经济又高效。最佳的转染条件，因不同的细胞类型和培养条件而有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
  • siRNA的推荐浓度为20μM，常用的浓度范围为10-50μM。
  • 对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的LP2000转染试剂和siRNA混合物分别配制，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀并孵育5分钟后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。
  • 对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。
• 无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔250μl LP2000转染试剂-siRNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
• 为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养4-6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞，推荐在转染4小时后更换培养液，对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染6小时后更换培养液)。
• 继续培养3-5天后，即可用适当方式检测siRNA对于靶基因的下调效果，例如qPCR、Western、ELISA、报告基因等。

常见问题：

• 转染效率低：
  
  • 优化质粒与LP2000转染试剂比例，对于难转染的细胞，可适当加大质粒用量。
  • 应用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用质粒大量抽提试剂盒(YT003)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
  • 贴壁细胞转染时状态良好，细胞密度达30-50%时才可进行转染，过稀可能影响转染效率，细胞密度达到50-90%时通常不会影响转染效率。不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞宜在对数生长期进行转染。
  • 需使用无抗生素和无血清培养液配制LP2000转染试剂和质粒或siRNA等的混合物。
  • 转染后培养时间不足，而被误以为转染效率偏低。不同细胞转染后至显著表达所需要培养的时间通常为24-48小时。
  • 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。
  • 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框完全正确。
  • 如果靶基因的敲减(knockdown)效果欠佳，应该考虑尝试设计不同的siRNA。
• 细胞毒性较大：
  
  • 缩短转染时间，在转染后较短时间内更换新鲜的细胞培养液。
  • 减少质粒用量，按照比例减少LP2000转染试剂。
  • 检查是否转染时细胞密度太低。

附录：
常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：

*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer,and the listed sizes are from Corning.
**These wells or dishes are square. 

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！